数字PCR凭借绝对定量和高灵敏度的优势，已成为分子诊断的重要工具。然而，在感染病原体联检、移植后监测、肿瘤突变基因检测等“一管多测”场景中，其多重检测能力长期受限：当前数字PCR以5′-水解探针（如TaqMan探针）化学为主，每个靶标通常要占用一条荧光通道，由此带来试剂成本上升、样本消耗增加和检测周期延长等问题，严重制约了数字PCR的应用。

2026年10月27日，厦门大学生命科学学院李庆阁教授团队在国际期刊Small在线发表了题为“Temperature-Resolved Coding for Highly Multiplexed Digital PCR Using MeltArray”的研究论文，实现了单反应体系内的高重数绝对定量。该研究提出了数字熔解阵列——一种“温度分辨的终点解码”策略。团队将前期开发的高阶多重PCR——熔解阵列体系，移植到静态微滴成像式数字PCR平台上，把熔解温度（T_m）转化为一个可编程的读出维度，从而在不增加荧光通道的前提下，显著提升了数字PCR的多重检测能力。

从原理上看，传统数字PCR主要依靠荧光颜色区分不同靶标，而数字熔解阵列的核心创新在于“以温度代替颜色”：靶标特异性媒介探针识别目标后被切割，释放出不同的媒介引物，并在通用分子信标报告序列上延伸，生成具有预设T_m的荧光报告双链体。扩增完成后，对同一批固定液滴进行阶梯式升温成像（如依次在50°C、60°C、70°C、80°C进行终点成像）。随着温度升高，低T_m信号被逐步“擦除”，高T_m信号则被保留；每个温度点的阳性液滴比例经泊松校正后得到累积分子浓度，再通过相邻温度状态间的差值计算，即可在群体水平上解析出各靶标的具体浓度（图1）。“先泊松校正、后相减”的解码顺序至关重要——该方法无需对单个液滴进行靶标归属，也无需实时追踪或采集完整的熔解曲线，从而大幅简化了检测流程。

图1: 数字熔解阵列累积温度分辨解码原理示意图。（A）媒介探针识别T1-T4，切割释放MP1-MP4，经通用报告序列延伸生成不同T_m报告双链。（B）单通道四靶标：常规熔解阵列按熔解峰区分（B左）；数字熔解阵列对同一批微滴于50-80°C依次终点成像（B右）。彩色、白色、叉号分别示阳性、阴性、擦除微滴，深浅示靶标；泊松校正后累积相减得各靶标浓度。

由于所有靶标共享同一套通用报告探针，荧光标记探针的数量不再随靶标数线性增加，显著降低了多重检测的试剂成本。同时，该体系支持在常规qPCR平台上完成引物与探针的设计与验证，再迁移至数字PCR平台进行绝对定量，从而形成“qPCR开发、数字PCR优化与应用”的便捷工作流程。

临床概念验证覆盖病毒监测与液体活检两大场景。

在移植后病毒监测方面，团队构建了13重数字熔解阵列体系，可在单反应内同时定量12种病毒及内参GAPDH。该体系仅使用FAM、HEX、ROX、Cy5和Atto 425标记的五种通用荧光分子信标报告探针，通过不同温度下的熔解信号差异识别不同病毒。对152例肾移植患者尿液cfDNA的检测结果显示，数字熔解阵列与单重水解探针数字PCR的定量结果高度一致（TTV：Pearson's r = 0.9945；JCV：Pearson's r = 0.9964）。值得注意的是，74例（49%）样本中检出两种及以上病毒共感染，充分展示了多重监测在有限样本量下的实用价值。

在肿瘤液体活检方面，团队开发了靶向KRAS/BRAF的10个热点突变及内参RPP30的11重数字熔解阵列体系，可在5%至0.005%的VAF范围内实现精准定量。其突变识别依赖于T_m差异：与突变序列完全匹配的媒介探针T_m高于退火温度，支持探针切割与报告产物生成；而与野生型序列存在错配的探针T_m低于退火温度，不产生可检测信号。在51例结直肠癌FFPE组织样本中，数字熔解阵列与NGS在样本层面完全一致，准确判定24例突变阳性与27例突变阴性；8例组织－血浆配对样本的检测结果与组织状态一致（4例阳性、4例阴性配对），其中包含低水平突变的血浆样本，验证了数字熔解阵列用于液体活检的可行性。

数字熔解阵列的另一独特优势在于其温度编码信号可与传统5′-水解探针信号在同一光学通道内正交共存：水解探针切割产生的荧光不可逆，高温下依然稳定；而数字熔解阵列信号在超过T_m后则被擦除。团队据此在13重移植后病毒体系中引入一条HSV-2水解探针（HSV-2由扩增曲线识别，ADV与HSV-1分别通过熔解峰T_m值识别），在不增加光学通道的情况下将检测能力扩展至14重；38份移植后临床样本的比较结果显示，新增1例HSV-2阳性检出，原13个靶标的检出率完全相同，配对阳性测量RMSE = 0.0533，定量性能未受影响（与单重数字PCR的R⟡ ≥ 0.9989）。

综上，数字熔解阵列将T_m从传统的“识别参数”转化为可编程的“数字编码维度”，在不牺牲数字PCR绝对定量优势的前提下，为高重数检测提供了一条无需采集完整熔解曲线、无需专用硬件的可拓展路径。此外，该技术还可与现有水解探针化学兼容，为构建“光谱×温度×探针信号”的多维数字PCR体系奠定了基础。

论文第一作者为厦门大学生命科学学院2025级博士研究生陈新强，通讯作者为李庆阁教授和许晔副教授。该研究获得国家自然科学基金、广西科技计划项目及厦门市科技计划项目的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1002/smll.76062

（图/文 李庆阁团队）