结核性胸膜炎（Tuberculous Pleurisy, TBP）是肺外结核中最常见的表现形式之一，也是临床诊断的难点。在结核病高流行地区，TBP可占渗出性胸腔积液病例的30%至80%。然而，由于TBP临床症状缺乏特异性，且胸腔积液中结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的细菌载量极低，现有诊断方法的灵敏度和特异度均难以满足临床需求，导致误诊和漏诊风险增加，患者治疗延误。因此，提升TBP的诊断准确性是亟待解决的临床挑战。

厦门大学生命科学学院李庆阁教授团队与福州肺科医院合作，系统解析了结核性胸腔积液中MTB游离DNA（cell free DNA, cfDNA）的生物学特征，并开发了一种基于MTB cfDNA 的多重微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）检测技术，显著提高了TBP的早期诊断效能。该研究成果12月9日在线发表于呼吸病学领域权威期刊Thorax，标志着我国在结核病精准诊断技术方面取得重要进展。

TBP诊断：现有方法灵敏度不足的瓶颈

当前TBP诊断主要依赖胸腔积液培养，但该方法耗时长达2–8周，阳性率仅约35%。即使采用分子生物学检测（如Xpert MTB/RIF），其灵敏度亦不足50%，腺苷脱氨酶（ADA）检测虽应用广泛，但易受其他炎症干扰，特异性较低。这些局限性提示：1）胸腔积液中的结核菌多已死亡或裂解，完整细菌稀少；2）传统PCR检测依赖完整的基因组DNA（gDNA），可能并非最佳检测靶标；3）胸腔积液中大量白细胞释放的人源DNA严重干扰核酸检测，进一步降低了检测灵敏度。

cfDNA：被低估的诊断标志物

研究团队聚焦于MTB cfDNA，首先比较了30例胸腔积液样本中MTB cfDNA与gDNA的相对丰度，发现cfDNA不仅普遍存在，且浓度更显著高于gDNA，表明cfDNA可能是TBP更具潜力的诊断靶标。进而，团队通过数字PCR实验对4例胸腔积液样本中MTB cfDNA长度分布进行表征（图1A-C），揭示了其独特的片段化模式：MTB cfDNA高度碎片化，表观长度集中分布于60-80碱基对（bp），且小于80 bp的短片段占比超过50%（图1D-F）。

图1. 解析胸腔积液中结核cfDNA的特征。(A)IS6110区域扩增子示意图；(B) 毛细管电泳评估DNA模板长度；(C) PCR扩增未碎片化与碎片化的H37Rv gDNA；(D) 五例确诊TBP患者胸腔积液样本的ddPCR拷贝数；(E) 样本中拷贝数的归一化检测；(F) 不同大小区间下患者MTB cfDNA的长度分布。

多重ddPCR：微弱信号的精准捕获

基于上述发现，团队开发了一种多重ddPCR检测体系，同步靶向MTB基因组中两个高拷贝数插入序列IS6110和IS1081（图2A），并将扩增子长度优化至适配碎片化cfDNA模板。该体系的检测限（LOD）可达0.2个MTB基因组当量/反应（图2C），较传统方法（LOD通常为10-100 拷贝/反应）提升近50至数百倍。此外，ddPCR技术通过将反应体系分割为数万个微滴，实现对极低丰度靶DNA的绝对定量，并有效规避了背景人源DNA的干扰。

图2. MTB cfDNA ddPCR检测方法的分析评价。(A) ddPCR检测中不同靶点数量和输出稳定性分析；(B) TB ddPCR检测的典型结果；(C) TB ddPCR体系检测下限（LOD）分析。

前瞻性临床队列验证

研究团队在356例疑似TBP患者的前瞻性队列中评估了该技术的临床性能。结果显示，在微生物学确诊的TBP患者中，cfDNA ddPCR的灵敏度达94.2% （65/69），显著优于Xpert MTB/RIF（52.0%，26/50）和液体培养（35.3%，24/68）（图3A、B）。在208例非结核性胸腔积液样本中，仅5例出现假阳性，特异性达97.0%。进一步分析显示，确诊TBP患者（69）和临床诊断TBP患者（68）胸腔积液中的MTB cfDNA普遍高于MTB gDNA，但两者均低于人源背景DNA水平（图3G）。

图3. MTB cfDNA ddPCR在结核性胸膜炎患者中的诊断表现。(A)TBP患者的各项检测结果；(B)TBP患者中MGIT培养、Xpert MTB/RIF和cfDNA ddPCR阳性结果的韦恩图；(C)cfDNA与gDNA阳性配对胸腔积液样本的核酸含量比较；(D)培养阳性与阴性胸腔积液样本中cfDNA含量比较；(E)不同年龄组胸腔积液中cfDNA含量比较；(F)不同ADA水平样本中cfDNA含量比较；(G)确诊与临床诊断TBP患者的MTB cfDNA和gDNA核酸分布。

本研究不仅证实了MTB cfDNA是胸腔积液中更优的诊断标志物，还首次系统阐明了其片段化特征及对检测效能的影响，为优化分子诊断流程提供了理论依据，也为其他低菌量感染性疾病的快速诊断提供了可借鉴的技术范式。

该论文的共同第一作者为厦门大学生命科学学院博士研究生张思琦、厦门大学生命科学学院许晔副教授及福州肺科医院黄明翔主任医师，通讯作者为李庆阁教授。研究获得国家自然科学基金、福建省科技重大专项及厦门市科技计划等项目的资助。

文章链接：https://thorax.bmj.com/content/early/2025/12/08/thorax-2025-223553.long

（图/文 李庆阁课题组）